Cuando realice pruebas diarias, encontrará que algunos elementos, como heptanosulfonato de sodio, hidróxido de tetrabutilamonio, bromuro de tetrabutilamonio y otros reactivos, se agregan a la fase móvil utilizada en el estándar de prueba. A estos reactivos los llamamos reactivos de emparejamiento iónico, que se pueden utilizar para mejorar la separación y la forma de los picos, reducir el rango de retención de las muestras, etc. Los reactivos de emparejamiento iónico pueden verse como una manifestación de la introducción de la cromatografía iónica en la cromatografía líquida de alta resolución. Hoy les hablaré sobre los fundamentos de la retención y algunos temas especiales en cromatografía de pares iónicos.

La cromatografía de pares iónicos (IPC) puede verse como una forma modificada de cromatografía de fase reversa con el objetivo de separar muestras iónicas. La única diferencia entre IPC y RPC es que IPC agrega reactivos de apareamiento iónico R o R- a la fase móvil, que pueden interactuar con A- para compuestos ácidos o BH para compuestos básicos durante el equilibrio:

par iónico de soluto ionizado

(ácido) A- R ⇔ A-R

(base) BH R- ⇔ BH R-

Soluto hidrofílico Par de iones hidrofóbicos

(menos reservado en RPC) (más reservado en RPC)

El uso de IPC puede producir un cambio en el comportamiento de retención de la muestra similar al cambio del pH de la fase móvil, pero el IPC puede controlar mejor el comportamiento de retención de solutos ácidos o básicos sin la necesidad de utilizar pH extremos (como pH <2,5 o pH>8). ). Los reactivos de apareamiento iónico típicos incluyen sulfonatos de alquilo R-SO3-(R-) y sales de tetraalquilamonio R4N (R ), y ácidos carboxílicos fuertes (generalmente ionizados) (ácido tetrafluoroacético, TFA; ácido heptafluoroacético), anhídrido butírico, HFBA (R-), y los llamados caotropos (BF4-, ClO4-, PF6-).

Actualmente existen dos teorías sobre el mecanismo de retención del IPC.

Un argumento es que los pares iónicos se forman en solución y luego se retienen en la columna, y el proceso de equilibrio de retención del soluto es el siguiente (tomando como ejemplo el par iónico formado por el soluto ácido ionizado A- y la sal de tetraalquilamonio R):

A-R (fase móvil) ⇔ A-R (fase estacionaria)

Según esta afirmación, la retención de solutos está determinada por:

① La parte ionizada de la molécula de soluto A en la fase móvil (dependiendo del pH de la fase móvil y del pKa del soluto)

② La concentración del reactivo IPC y su tendencia a formar pares de iones.

③ valor k del complejo de pares iónicos A-R

Otra forma de decir que el reactivo IPC es retenido primero por la fase estacionaria y luego la retención del soluto es un proceso de intercambio iónico, por ejemplo, fase móvil ácida ionizada A- y reactivo IPC R X-:

A- (fase móvil) R X- (fase estacionaria)

        ⇕

A-R (fase estacionaria) X- (fase móvil)

Es decir, el reactivo de apareamiento iónico R X- se adsorbe primero en la fase estacionaria y luego el ion de muestra A- reemplaza al contraión X- en la fase estacionaria. Ambos procesos de retención de IPC pueden prevalecer en cualquier separación dada, pero cuál mecanismo juega un papel más importante no es fácil de determinar ni prácticamente importante.

En IPC, las condiciones de separación que se pueden utilizar para controlar la selectividad incluyen:

➩pH

➩ Tipos de reactivos IPC (sulfonatos, sales de amonio cuaternario, agentes caotrópicos)

➩ Concentración del reactivo IPC

➩ Resistencia al disolvente (B%)

➩ Tipo de disolvente (metanol, acetonitrilo, etc.)

➩ Temperatura

➩ Tipo de columna

➩ Tipo y concentración de solución tampón

Se pueden utilizar reactivos inorgánicos (o “agentes caotrópicos”) como ClO4-, BF4- y PF6- en lugar de los alquilsulfonatos comúnmente utilizados como reactivos de IPC. Los reactivos inorgánicos tienen menos retención en la fase estacionaria y su mecanismo de retención se acerca más al primer enunciado anterior, formando pares de iones en la fase móvil. Los caotropos son mejores para la elución en gradiente (menos ruido de referencia y deriva) y se disuelven mejor en la fase móvil cuando el B% es mayor.

Sin embargo, el uso de reactivos de apareamiento iónico tiene algunos problemas especiales; en algunos casos se requiere un control estricto del pH de la fase móvil; La reproducibilidad del control de temperatura debe ser alta (más requerida que RPC). Además, algunos problemas en IPC no ocurren en RPC. Aparece en separación o difiere de otros RPC. También hay picos espurios, un equilibrio lento de la columna que cambia la fase móvil y formas de picos cromatográficos deficientes por razones desconocidas.

El primero son los picos espurios. Al inyectar el disolvente de la muestra (sin muestra) en el IPC (es decir, experimento en blanco), a veces observamos picos positivos y negativos al mismo tiempo. Los picos de artefactos suelen ser causados ​​por diferencias en la composición de la fase móvil y el disolvente de la muestra. El uso de reactivos de IPC, tampones u otros aditivos de fase móvil impuros puede exacerbar el problema de los picos espurios.

A esto le sigue un lento equilibrio de la columna. Cuando se utiliza una nueva fase móvil, la columna se debe lavar con un volumen suficiente de fase móvil para equilibrar la columna. En IPC, la adsorción y desorción de los reactivos de IPC en la columna es en algunos casos muy lenta, lo que puede provocar que la columna no esté completamente equilibrada con la nueva fase móvil. Entonces, ya sea que la fase móvil antigua o la nueva fase móvil contenga reactivos de IPC, debemos estar seguros de que la retención de la muestra después de cambiar la fase móvil sea reproducible (lo que requiere varias horas de lavado de la columna con la nueva fase móvil para lograr el equilibrio completo). ). Al reemplazar el reactivo de IPC, primero use un eluyente especial para eluir el reactivo de IPC previamente adsorbido en la columna cromatográfica y luego equilibre con una nueva columna cromatográfica de fase móvil.

Los reactivos aniónicos (tales como alquilsulfonatos) se pueden eluir con eluyentes compuestos de 50 % a 80 % de metanol-agua; las sales de amonio cuaternario requieren un tampón de metanol al 50% (p. ej., pH de 4 a 5). Solución de hidrogenofosfato dipotásico de 100 mmol/L, agregar hidrogenofosfato dipotásico es para reducir la interacción entre el grupo de amonio cuaternario y el grupo silanol ionizado en la fase estacionaria). En cualquier caso, primero se debe lavar la columna con al menos 20 volúmenes de columna de eluyente antes de equilibrar la columna con una nueva fase móvil. Además, los tampones de apareamiento iónico más débiles, como el ácido trifluoroacético (TFA) y los agentes caotrópicos, no ralentizan el proceso de equilibrio de la columna, y lavar la columna con 10 a 20 veces la fase móvil que contiene TFA o agente caotrópico suele ser suficiente para lograr la columna. balance.

El equilibrio inicial de la columna con una fase móvil que contiene reactivos de IPC puede ser muy lento. Para evitar un equilibrio de 12 h antes de cada nueva serie de experimentos de rutina, recomendamos que la columna se sumerja en fase móvil (con reactivos de IPC) para almacenarla después de cada serie de experimentos. Este método conveniente permite un equilibrio de columna más rápido con ensayos de IPC; También recomendamos este método si se requieren repeticiones diarias o de dos días, sin embargo, su vida útil puede verse limitada al almacenarse de esta manera se acortará.

Debido al lento proceso de equilibrio del reactivo de IPC con la columna, es imposible eluir completamente el reactivo de IPC de la columna incluso con un procedimiento de elución más vigoroso. Por este motivo, recomendamos que las columnas que han sido separadas mediante IPC no se utilicen para separaciones RPC sin reactivos de IPC (con excepción de TFA y caotropos).

Si se observa una forma de pico deficiente y/o valores bajos de N para el número de placas de la columna en IPC, considere cambiar la temperatura de la columna.

Lo anterior es el principio de retención de la cromatografía de pares iónicos y las soluciones a algunos problemas especiales. Espero que sea útil para todos utilizar la cromatografía de pares iónicos en el futuro.