Cuando realiza pruebas diarias, encontrará que algunos elementos, como heptano sulfonato de sodio, hidróxido de tetrabutilamonio, bromuro de tetrabutilamonio y otros reactivos, se agregan a la fase móvil utilizada en el estándar de prueba. A estos reactivos los llamamos Reactivos de emparejamiento de iones, que se pueden usar para mejorar la separación y la forma de los picos, reducir el rango de retención de las muestras, etc. Los reactivos de emparejamiento de iones pueden verse como una manifestación de la introducción de la cromatografía iónica en la cromatografía líquida de alta resolución. Hoy les hablaré sobre los fundamentos de la retención y algunos temas especiales en la cromatografía de pares iónicos.

La cromatografía de par de iones (IPC) puede verse como una forma modificada de cromatografía de fase reversa con el objetivo de separar muestras iónicas. La única diferencia entre IPC y RPC es que IPC agrega reactivos de apareamiento iónico R o R- a la fase móvil, que pueden interactuar con A- para compuestos ácidos o BH para compuestos básicos durante el equilibrio:

par de iones de soluto ionizado

(ácido) A-R ⇔ A-R

(base) BH R- ⇔ BH R-

Soluto hidrofílico Par de iones hidrofóbicos

(menos reservado en RPC) (más reservado en RPC)

El uso de IPC puede producir un cambio en el comportamiento de retención de la muestra similar a cambiar el pH de la fase móvil, pero IPC puede controlar mejor el comportamiento de retención de solutos ácidos o básicos sin la necesidad de usar un pH extremo (como pH<2.5 o pH>8). ). Los reactivos de apareamiento iónico típicos incluyen sulfonatos de alquilo R-SO3-(R-) y sales de tetraalquilamonio R4N (R ), y ácidos carboxílicos fuertes (generalmente ionizados) (ácido tetrafluoroacético, TFA; ácido heptafluoroacético), anhídrido butírico, HFBA (R-), y los llamados caotropos (BF4-, ClO4-, PF6-).

Actualmente existen dos teorías sobre el mecanismo de retención de IPC.

Un argumento es que los pares de iones se forman en solución y luego se retienen en la columna, y el proceso de equilibrio de retención de soluto es el siguiente (tomando el par de iones formado por el soluto ácido ionizado A- y la sal de tetraalquilamonio R como ejemplo):

A-R (fase móvil) ⇔ A-R (fase estacionaria)

De acuerdo con esta afirmación, la retención de solutos está determinada por:

① La parte ionizada de la molécula de soluto A en la fase móvil (dependiendo del pH de la fase móvil y el pKa del soluto)

② La concentración del reactivo IPC y su tendencia a formar pares de iones

③ Valor k del complejo de pares de iones A-R

Otra forma de decir que el reactivo IPC primero es retenido por la fase estacionaria, y luego la retención de soluto es un proceso de intercambio iónico, por ejemplo, fase móvil ácida ionizada A- y reactivo IPC R X-:

A- (fase móvil) R X- (fase estacionaria)

        ⇕

A-R (fase estacionaria) X- (fase móvil)

Es decir, el reactivo de apareamiento de iones R X- se adsorbe primero en la fase estacionaria y luego el ion de muestra A- reemplaza al contraión X- en la fase estacionaria. Ambos procesos de retención de IPC pueden prevalecer en cualquier separación dada, pero qué mecanismo juega un papel más importante no es fácil de determinar ni importante en la práctica.

En IPC, las condiciones de separación que se pueden usar para controlar la selectividad incluyen:

➩ pH

➩ Tipos de reactivos IPC (sulfonatos, sales de amonio cuaternario, agentes caotrópicos)

➩ Concentración de reactivo IPC

➩ Fuerza del solvente (B%)

➩ Tipo de disolvente (metanol, acetonitrilo, etc.)

➩ Temperatura

➩ Tipo de columna

➩ Tipo y concentración de la solución tampón

Los reactivos inorgánicos (o "agentes caotrópicos") como ClO4-, BF4- y PF6- se pueden usar en lugar de los sulfonatos de alquilo comúnmente utilizados como reactivos IPC. Los reactivos inorgánicos tienen menos retención en la fase estacionaria, y su mecanismo de retención es más cercano a la primera afirmación anterior, formando pares de iones en la fase móvil. Los caotropos son mejores para la elución en gradiente (menos ruido de línea base y deriva) y se disuelven mejor en la fase móvil cuando el B% es más alto.

Sin embargo, el uso de reactivos de apareamiento de iones tiene algunos problemas especiales, en algunos casos se requiere un control estricto del pH de la fase móvil; la reproducibilidad del control de temperatura debe ser alta (más requerida que RPC), además, algunos problemas en IPC no ocurren en RPC Aparece en separación o difiere de otros RPC. También hay picos espurios, equilibrio de columna lento que cambia la fase móvil y formas de picos cromatográficos deficientes por razones desconocidas.

El primero son los picos espurios. Al inyectar el solvente de muestra (sin muestra) en el IPC (es decir, experimento en blanco), a veces observamos picos positivos y negativos al mismo tiempo. Los picos de artefactos generalmente son causados ​​por diferencias en la composición de la fase móvil y el solvente de la muestra. El uso de reactivos IPC, tampones u otros aditivos de fase móvil impuros puede exacerbar el problema de los picos espurios.

A esto le sigue un equilibrado lento de la columna. Cuando se utiliza una nueva fase móvil, la columna debe lavarse con un volumen suficiente de fase móvil para equilibrar la columna. En IPC, la adsorción y desorción de los reactivos de IPC en la columna es, en algunos casos, muy lenta, lo que puede hacer que la columna no se equilibre completamente con la nueva fase móvil. Por lo tanto, ya sea que la fase móvil antigua o la fase móvil nueva contengan reactivos IPC, debemos asegurarnos de que la retención de la muestra después de cambiar la fase móvil sea reproducible (lo que requiere varias horas de enjuague de la columna con la nueva fase móvil para lograr el equilibrio completo). ). Cuando reemplace el reactivo IPC, primero use un eluyente especial para eluir el reactivo IPC previamente adsorbido en la columna cromatográfica y luego equilibre con una nueva columna cromatográfica de fase móvil.

Los reactivos aniónicos (como los sulfonatos de alquilo) se pueden eluir con eluyentes compuestos de 50% a 80% de metanol-agua; las sales de amonio cuaternario requieren un tampón de metanol al 50% (p. ej., pH de 4 a 5). Solución de hidrogenofosfato de dipotasio de 100 mmol/L, agregar hidrogenofosfato de dipotasio es para reducir la interacción entre el grupo amonio cuaternario y el grupo silanol ionizado en la fase estacionaria). En cualquier caso, la columna debe enjuagarse primero con al menos 20 volúmenes de columna de eluyente antes de equilibrar la columna con una nueva fase móvil. Además, los tampones de emparejamiento de iones más débiles, como el ácido trifluoroacético (TFA) y los agentes caotrópicos, no ralentizan el proceso de equilibrio de la columna y, por lo general, es suficiente lavar la columna con 10 a 20 veces la fase móvil que contiene TFA o agente caotrópico para lograr la estabilidad de la columna. balance.

El equilibrio inicial de la columna con una fase móvil que contiene reactivos IPC puede ser muy lento. Para evitar el equilibrio de 12 horas antes de cada nueva serie de experimentos de rutina, recomendamos que la columna se empape en fase móvil (con reactivos IPC) para almacenarla después de cada serie de experimentos. Este método conveniente permite equilibrar la columna más rápido con ensayos IPC; También recomendamos este método si se requieren repeticiones diarias o de dos días, sin embargo, su vida útil puede verse limitada cuando se acortará almacenado de esta manera.

Debido al lento proceso de equilibrio del reactivo IPC con la columna, es imposible eluir completamente el reactivo IPC de la columna incluso con un procedimiento de elución más vigoroso. Por este motivo, recomendamos que las columnas que hayan sido separadas por IPC no se utilicen para separaciones RPC sin reactivos IPC (a excepción de TFA y caotropos).

Si se observa una forma de pico deficiente y/o valores bajos de N para el número de platos de la columna en IPC, considere cambiar la temperatura de la columna.

Lo anterior es el principio de retención de la cromatografía de pares de iones y las soluciones a algunos problemas especiales. Espero que sea útil para todos usar la cromatografía de par iónico en el futuro.