Como todos sabemos, la cromatografía puede resolver el problema de la separación y el análisis de mezclas complejas de múltiples componentes, como homólogos e isómeros con constantes físicas similares y propiedades químicas similares, y no solo puede identificar compuestos sino también realizar determinaciones cuantitativas. La cromatografía se basa en un análisis cuantitativo basado en el área o altura de los picos cromatográficos. Existen muchos métodos de cálculo cuantitativo cromatográfico. En la actualidad, existen tres métodos ampliamente utilizados: método de normalización, método de estándar interno y método de estándar externo. Hoy compartiré brevemente con ustedes varios métodos cuantitativos comúnmente utilizados en cromatografía.

Método de normalización

Dado que la cantidad de un componente es proporcional a su área de pico, si todos los componentes de la muestra pueden generar señales y obtener los picos cromatográficos correspondientes, se puede utilizar la siguiente fórmula de normalización para calcular el contenido de cada componente.

En la fórmula:

C representa el contenido
F significa factor de corrección
A es el área del pico

Si el factor de corrección de cada componente de la muestra es similar, se puede eliminar el factor de corrección y utilizar directamente la normalización del área del pico para el cálculo. La Farmacopea China utiliza el método de normalización de área sin factor de corrección para determinar el límite de cada impureza y la cantidad total de impurezas en el fármaco.

Ventaja:

Proceso cuantitativo simple y rápido
El volumen de inyección no es estrictamente necesario.

Defecto:

Todos los picos de los componentes deben eluir
Es necesario medir todos los componentes.
Todos los picos deben corregirse.

Método estándar interno

La sustancia pura no contenida en la muestra se selecciona como sustancia de referencia y se agrega a la solución de la muestra a analizar, y el método para determinar el contenido del componente probado comparando las señales de respuesta del componente probado y la sustancia de referencia se llama método de estándar interno. El origen del “estándar interno” se debe a que la sustancia estándar (control) se agrega a la muestra, lo cual es diferente del método estándar externo. Esta sustancia de control se llama estándar interno.

No todos los componentes pueden salir de la columna cromatográfica en un ciclo de análisis (como los componentes de gasificación difíciles), o el detector no puede generar una señal para cada componente, o solo es necesario determinar el contenido de unos pocos componentes en la mezcla, el Se puede utilizar el método estándar interno.

Pese con precisión W gramos de la muestra y luego pese con precisión W gramos del estándar interno, agréguelo a la muestra, mezcle bien e inyecte la muestra. Mida el área del pico Ai del componente i a medir y el área del pico As del estándar interno, entonces el peso Wi del componente i contenido en la muestra de W gramos tiene la siguiente relación con el peso Ws del estándar interno:

El porcentaje C% del componente i que se va a analizar en la muestra es:

Requisitos para estándares internos:

El estándar interno es un componente que no está contenido en la muestra original; de lo contrario, los picos se superpondrán y el área del pico del estándar interno no se podrá medir con precisión.
El tiempo de retención del estándar interno debe ser similar al de los componentes a ensayar, pero pueden separarse completamente entre sí (R≥1,5)
El patrón interno debe ser una sustancia pura con la pureza requerida.

Ventaja:

Dentro del rango en el que el volumen de inyección no supera el límite (la columna no está sobrecargada), los resultados cuantitativos no tienen nada que ver con la repetibilidad del volumen de inyección.
Siempre que los componentes medidos y el estándar interno tengan picos y la resolución cumpla con los requisitos, se pueden cuantificar, independientemente de si otros componentes tienen picos.
Es muy adecuado para medir el contenido de trazas de ingredientes activos o impurezas en medicamentos. Dado que el contenido de impurezas (o componentes traza) es muy diferente del de los componentes principales, el contenido no se puede determinar mediante el método de normalización y es muy conveniente utilizar el método estándar interno.

Defecto: Añadir un patrón interno equivalente a la cantidad de impurezas. Aumente el volumen de inyección para resaltar el pico de impureza y mida la relación entre el pico de impureza y el área del pico del estándar interno para obtener el contenido de impureza. Sin embargo, la preparación de muestras es engorrosa y los estándares internos son difíciles de encontrar.

Método estándar externo (método de curva de calibración, algoritmo de cálculo del factor de corrección)

El método estándar externo se refiere a agregar una cierta cantidad de sustancia estándar (sustancia de referencia) en un gradiente para preparar una muestra de control en un solvente en blanco y realizar el procesamiento y la detección de la muestra en paralelo con la muestra desconocida. Se inyectan diferentes concentraciones de muestras estándar y el área del pico se utiliza como valor para dibujar una curva estándar, a fin de calcular el método cuantitativo de la concentración del componente medido en la muestra desconocida. El método estándar externo se puede dividir en método de curva de calibración y algoritmo de cálculo del factor de corrección en funcionamiento.

Método de curva de calibración: tome la sustancia pura para preparar soluciones estándar de diferentes concentraciones y use un cromatógrafo para hacer una curva estándar de la relación entre el área del pico y la concentración. La concentración del componente a probar se puede determinar directamente mediante la curva estándar.

Algoritmo de cálculo del factor de corrección: Consiste en obtener la señal de respuesta y su contenido después de analizar la muestra estándar muchas veces para obtener su factor de corrección absoluto y luego calcular el contenido en la muestra a probar de acuerdo con la fórmula.

En la fórmula:
C significa contenido
F significa factor de corrección
A es el área del pico

Ventajas: Operación y cálculo simples, no es necesario detectar todos los picos.

Desventajas: El volumen de inyección debe ser preciso y el instrumento requiere buena estabilidad.