La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) usa un relleno con hidrofobicidad moderada como fase estacionaria y una solución acuosa que contiene sal como fase móvil, y usa la diferencia en las propiedades hidrofóbicas de las moléculas de soluto para lograr la separación por la diferencia en la fuerza de la interacción hidrofóbica con la fase estacionaria, método cromatográfico. Debido a que el principio de separación de la cromatografía de interacción hidrofóbica es completamente diferente de las técnicas cromatográficas como la cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía de filtración en gel, esta técnica se usa a menudo en combinación con las dos últimas para separar muestras biológicas complejas. En la actualidad, el principal campo de aplicación de esta tecnología es la purificación de proteínas, y se ha convertido en un medio eficaz para la separación de proteínas séricas, proteínas unidas a membrana, proteínas nucleares, receptores, proteínas recombinantes, etc., así como para la algunas moléculas de fármacos, e incluso células.

Para las moléculas pequeñas, se pueden dividir en moléculas hidrofílicas y moléculas hidrofóbicas según su polaridad. En términos generales, las moléculas pequeñas hidrofílicas son difíciles de interactuar con los medios HIC. Pero para las macromoléculas biológicas como las proteínas, que son los principales objetivos de HIC, su hidrofilia o hidrofobicidad son relativas. Incluso las moléculas hidrofílicas tendrán regiones hidrofóbicas locales, que pueden causar interacciones hidrofóbicas con los medios HIC. Por lo tanto, se puede separar según la fuerza relativa de su hidrofobicidad.

Los medios HIC están compuestos por ligandos hidrófobos, como grupos alquilo o aromáticos, unidos a una matriz específica, como la agarosa. Se cree que la interacción entre los medios HIC y las biomoléculas hidrofóbicas está impulsada por el aumento de la entropía y el cambio en la energía libre, al igual que la agregación espontánea de moléculas hidrofóbicas en los sistemas acuosos. Las sales juegan un papel muy importante en la interacción hidrofóbica. La presencia de altas concentraciones de sales puede interactuar fuertemente con las moléculas de agua, lo que resulta en la reducción de moléculas de agua que pueden formar agujeros alrededor de las moléculas hidrofóbicas, lo que promueve la hidrofobicidad entre las moléculas hidrofóbicas y el medio cromatográfico. unión entre ligandos.

Por lo tanto, en el proceso HIC, se utiliza una solución con alta concentración de sal en la etapa de adsorción de la muestra, para que las moléculas objetivo se unan en la columna cromatográfica, y en la etapa de elución, se hace la hidrofobicidad entre el soluto y el medio cromatográfico. reduciendo la concentración de sal en el eluyente. El efecto se debilita, por lo que se desorbe de la columna y se eluye. Para los medios cromatográficos con grupos aromáticos como ligandos hidrófobos, también existe una posibilidad potencial de interacción π-π. Cuando la superficie de la sustancia a separar tiene grupos aromáticos, mostrará una separación mixta de interacción hidrofóbica e interacción π-π. modelo.

En teoría, HIC y RPC son dos técnicas de cromatografía líquida estrechamente relacionadas, ambas basadas en la interacción flujo-agua entre las regiones hidrofóbicas en la superficie de las biomoléculas y los ligandos hidrofóbicos (alquilo o aromático) en el medio cromatográfico. Sin embargo, los mecanismos cromatográficos tanto a nivel molecular como a nivel práctico difieren entre las dos técnicas.

El grado de sustitución de los ligandos hidrófobos en los medios RPC es mucho mayor que en los medios HIC. El medio RPC se puede considerar como una fase hidrófoba continua, y el grado de sustitución de ligandos como los grupos alquilo C4~C18 suele ser de cientos de micromoles/ml de gel: mientras que el medio HIC tiene ligandos como los grupos alquilo C2~C o grupos aromáticos simples. El grado de sustitución suele estar en el rango de 10-50 mmol/mL de gel, lo que puede considerarse como una fase hidrófoba discontinua, en la que participan uno o varios ligandos cuando se unen a biomoléculas.

Obviamente, la interacción entre el soluto hidrofóbico y el medio RPC es mucho más fuerte que la del medio HIC, y se requieren condiciones de elución severas tales como gradientes de solventes orgánicos para eluir el soluto de la columna. La desnaturalización tiende a ocurrir bajo las condiciones de elución de RPC, por lo que RPC es adecuado para la separación y purificación de péptidos y pequeñas moléculas de proteína con buena estabilidad en sistemas de solventes orgánicos de agua, mientras que las condiciones de elución del proceso HIC son mucho más suaves y generalmente reducen la elución Por lo tanto, HIC no solo aprovecha las propiedades hidrofóbicas de las proteínas, sino que también puede llevarse a cabo en un entorno más polar y menos desnaturalizante, por lo que tiene una aplicación más amplia en la purificación de proteínas.

La influencia de las condiciones de la fase móvil en HIC se manifiesta principalmente en el tipo y concentración de las sales utilizadas, el pH de la fase móvil y la influencia de otros aditivos. El proceso HIC logra la adsorción de la muestra a una alta concentración de sal y luego completa el proceso de elución a una baja concentración de sal. Claramente, el tipo y la concentración de sales en la fase móvil son parámetros cruciales en HIC. Diferentes iones, especialmente aniones, tienen diferentes roles en HIC. Algunos iones en solución promueven la precipitación de proteínas y pueden aumentar la interacción hidrofóbica; mientras que la presencia de otros iones promueve la disolución de proteínas, llamadas sales solubilizantes, su presencia destruye la interacción hidrofóbica. La siguiente tabla indica el efecto de diferentes iones en la interacción hidrofóbica. Los iones de la izquierda en la tabla pueden promover la interacción hidrofóbica y, por lo tanto, se usan a menudo en HIC, mientras que los iones de la derecha pertenecen a los iones solubilizantes, que pueden destruir la interacción hidrofóbica y, a veces, se usan en medios cromatográficos. Se puede utilizar para eluir algunas impurezas especialmente ligadas durante la limpieza.

Con la condición de que se haya determinado el tipo de sal utilizada, el nivel de concentración de sal afectará la fuerza de unión de las moléculas de soluto y el medio cromatográfico y la capacidad de unión del medio cromatográfico. La concentración elevada de sal puede promover la interacción hidrofóbica, por lo que el HIC generalmente se carga y adsorbe a una concentración alta de sal y se eluye al reducir la concentración de sal en el eluyente. Además, la concentración salina inicial del proceso de cromatografía también afectará la capacidad de unión del medio de cromatografía para las proteínas.

El valor de pH de la solución considera principalmente el entorno de pH que puede mantener la actividad biológica de las macromoléculas biológicas. En general, cuando el pH de la solución se acerca al punto isoeléctrico de la proteína, aumenta su hidrofobicidad, lo que favorece la interacción con el ligando inmovilizado; lejos de su punto isoeléctrico, su hidrofobicidad disminuye, lo que no favorece la unión con el ligando inmovilizado, pero es beneficioso para la proteína eluida. Por lo tanto, la hidrofobicidad de la proteína también se puede cambiar cambiando el pH de la solución.

Diferentes sales tienen un impacto en la fuerza de la interacción hidrofóbica y la selectividad en la cromatografía también es diferente; la concentración de sal también varía con la hidrofobicidad de la molécula objetivo, el (NH4)2SO4 suele ser de 0,75~2 mol/L y el NaCl es de 1~4 mol/L; el método de elución más común es reducir la concentración de sal en la fase móvil. La fase móvil B es un tampón con menor contenido de sal. El tipo de tampón es el mismo que el de la fase móvil A, y el B% es de 0 a 100. Agregue solventes orgánicos a la fase móvil, como etilenglicol, propanol, isopropanol, etc., para reducir la polaridad del móvil. fase a eluir; agregue detergentes a la fase móvil, y el detergente en sí puede interactuar con el medio. Se adsorbe fuertemente, desplazando así los componentes objetivo unidos a él.