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2025-02-21La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) utiliza una carga con hidrofobicidad moderada como fase estacionaria y una solución acuosa que contiene sal como fase móvil, y utiliza la diferencia en las propiedades hidrofóbicas de las moléculas del soluto para lograr la separación por la diferencia en la fuerza de la interacción hidrofóbica con la fase estacionaria, método cromatográfico. Debido a que el principio de separación de la cromatografía de interacción hidrófoba es completamente diferente de las técnicas cromatográficas como la cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía de filtración en gel, esta técnica se usa a menudo en combinación con las dos últimas para separar muestras biológicas complejas. En la actualidad, el principal campo de aplicación de esta tecnología es la purificación de proteínas, convirtiéndose en un medio eficaz para la separación de proteínas séricas, proteínas de membrana, proteínas nucleares, receptores, proteínas recombinantes, etc., así como algunas moléculas de fármacos e incluso células.
Para las moléculas pequeñas, se pueden dividir en moléculas hidrófilas y moléculas hidrófobas según su polaridad. En términos generales, las moléculas pequeñas hidrófilas tienen dificultades para interactuar con los medios HIC. Pero para las macromoléculas biológicas como las proteínas, que son los principales objetivos de la HIC, su hidrofilicidad o hidrofobicidad son relativas. Incluso las moléculas hidrófilas tendrán regiones hidrófobas locales, lo que puede provocar interacciones hidrófobas con los medios HIC. Por lo tanto, se puede separar según la fuerza relativa de su hidrofobicidad.
Los medios HIC están compuestos de ligandos hidrofóbicos como alquilo o grupos aromáticos unidos a una matriz específica como la agarosa. Se cree que la interacción entre los medios HIC y las biomoléculas hidrofóbicas está impulsada por el aumento de la entropía y el cambio en la energía libre, al igual que la agregación espontánea de moléculas hidrofóbicas en sistemas acuosos. Las sales juegan un papel muy importante en la interacción hidrofóbica. La presencia de altas concentraciones de sales puede interactuar fuertemente con las moléculas de agua, lo que resulta en la reducción de las moléculas de agua que pueden formar agujeros alrededor de las moléculas hidrofóbicas, lo que promueve la hidrofobicidad entre las moléculas hidrofóbicas y el medio cromatográfico. unión entre ligandos.
Por lo tanto, en el proceso HIC, se utiliza una solución con alta concentración de sal en la etapa de adsorción de la muestra, de modo que las moléculas objetivo se unen en la columna cromatográfica, y en la etapa de elución, se logra la hidrofobicidad entre el soluto y el medio cromatográfico. reduciendo la concentración de sal en el eluyente. El efecto se debilita, por lo que se desorbe de la columna y se eluye. Para medios cromatográficos con grupos aromáticos como ligandos hidrófobos, también existe una posibilidad potencial de interacción π-π. Cuando la superficie de la sustancia a separar tiene grupos aromáticos, mostrará una separación mixta de interacción hidrófoba e interacción π-π. modelo.
En teoría, HIC y RPC son dos técnicas de cromatografía líquida estrechamente relacionadas, las cuales se basan en la interacción flujo-agua entre las regiones hidrofóbicas en la superficie de las biomoléculas y los ligandos hidrofóbicos (alquílicos o aromáticos) en el medio cromatográfico. Sin embargo, Los mecanismos cromatográficos a nivel molecular así como a nivel práctico difieren entre las dos técnicas.
El grado de sustitución de ligandos hidrofóbicos en medios RPC es mucho mayor que en medios HIC. El medio RPC se puede considerar como una fase hidrófoba continua, y el grado de sustitución de ligandos como los grupos alquilo C4~C18 suele ser de cientos de micromoles/mL de gel: mientras que el medio HIC tiene ligandos como los grupos alquilo C2~C o grupos aromáticos simples. El grado de sustitución suele estar en el rango de 10 a 50 mmol/ml de gel, que puede considerarse como una fase hidrófoba discontinua, en la que participan uno o varios ligandos cuando se une a biomoléculas.
Obviamente, la interacción entre el soluto hidrofóbico y el medio RPC es mucho más fuerte que la del medio HIC, y se requieren condiciones de elución severas, como gradientes de disolvente orgánico, para eluir el soluto de la columna. La desnaturalización tiende a ocurrir bajo las condiciones de elución de RPC, por lo que RPC es adecuado para la separación y purificación de péptidos y pequeñas moléculas de proteínas con buena estabilidad en sistemas de agua y solventes orgánicos, mientras que las condiciones de elución del proceso HIC son mucho más suaves y generalmente reducen La elución por tanto, HIC no sólo aprovecha las propiedades hidrofóbicas de las proteínas, sino que también puede realizarse en un ambiente más polar y menos desnaturalizante, por lo que tiene una aplicación más amplia en la purificación de proteínas.
La influencia de las condiciones de la fase móvil sobre la HIC se manifiesta principalmente en el tipo y concentración de las sales utilizadas, el pH de la fase móvil y la influencia de otros aditivos. El proceso HIC logra la adsorción de la muestra a una alta concentración de sal y luego completa el proceso de elución a una baja concentración de sal. Claramente, el tipo y la concentración de sales en la fase móvil son parámetros cruciales en HIC. Los diferentes iones, especialmente los aniones, tienen diferentes funciones en la HIC. Algunos iones en solución promueven la precipitación de proteínas y pueden aumentar la interacción hidrofóbica; mientras que la presencia de otros iones promueve la disolución de proteínas, llamadas sales solubilizantes, su presencia destruye la interacción hidrofóbica. La siguiente tabla indica el efecto de diferentes iones en la interacción hidrofóbica. Los iones de la izquierda de la tabla pueden promover la interacción hidrofóbica y, por lo tanto, se usan a menudo en HIC, mientras que los iones de la derecha pertenecen a los iones solubilizantes, que pueden destruir la interacción hidrofóbica y, a veces, se usan en medios cromatográficos. Puede utilizarse para eluir algunas impurezas especialmente ligadas durante la limpieza.
Bajo la condición de que se haya determinado el tipo de sal utilizada, el nivel de concentración de sal afectará la fuerza de unión de las moléculas del soluto y el medio cromatográfico y la capacidad de unión del medio cromatográfico. Una concentración elevada de sal puede promover la interacción hidrofóbica, por lo que el HIC generalmente se carga y se adsorbe a una concentración alta de sal y se eluye reduciendo la concentración de sal en el eluyente. Además, la concentración de sal inicial del proceso de cromatografía también afectará la capacidad de unión del medio de cromatografía a las proteínas.
El valor de pH de la solución considera principalmente el entorno de pH que puede mantener la actividad biológica de las macromoléculas biológicas. En general, cuando el pH de la solución está cerca del punto isoeléctrico de la proteína, aumenta su hidrofobicidad, lo que favorece la interacción con el ligando inmovilizado; lejos de su punto isoeléctrico, su hidrofobicidad disminuye, lo que no favorece la unión con el ligando inmovilizado, pero es beneficioso para la proteína eluida. Por tanto, la hidrofobicidad de la proteína también se puede cambiar cambiando el pH de la solución.
Las diferentes sales influyen en la fuerza de la interacción hidrófoba y la selectividad en la cromatografía también es diferente; la concentración de sal también varía con la hidrofobicidad de la molécula objetivo, (NH4)2SO4 suele ser de 0,75 a 2 mol/l y el NaCl es de 1 a 4 mol/l; El método de elución más común es reducir la concentración de sal en la fase móvil. La fase móvil B es un tampón con menor contenido de sal. El tipo de tampón es el mismo que el de la fase móvil A, y el % B es de 0 a 100. Agregue disolventes orgánicos a la fase móvil, como etilenglicol, propanol, isopropanol, etc., para reducir la polaridad del móvil. fase para eluir; agregue detergentes a la fase móvil y el detergente en sí puede interactuar con el medio. Se adsorbe fuertemente, desplazando así los componentes objetivo unidos a él.
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