Elección de columnas de gel

Al elegir una columna de gel, en términos de apariencia, textura y rendimiento, la columna seleccionada debe ser transparente y suave, con un diámetro interno uniforme, resistente a la presión y anticorrosión, y el material de la columna debe ser biocompatible y tener buenas propiedades físicas. y resistencia química y estabilidad. Los materiales generales de las columnas son principalmente vidrio o plexiglás. Al utilizar columnas de acero, se debe prestar especial atención a la anticorrosión. Además, la terminal de la columna debe tener un colector y una pantalla de filtro, y la placa inferior de la columna debe ser resistente a la presión y no debe bloquearse fácilmente. El volumen muerto debe ser inferior a 0,001 Vt. Si el volumen muerto es demasiado grande, los componentes separados se pueden volver a mezclar, lo que da como resultado una cola de los picos de elución y una resolución reducida. El medio filtrante de la placa inferior debe ser nuevo y tener mallas que puedan fusionarse con el gel. Evite el contacto con la malla y la superficie del medio filtrante, ya que las huellas dactilares pueden degradar la separación de la muestra. Todas las piezas deben limpiarse a fondo al empacar o volver a empacar la columna.

La longitud y el diámetro interior de la columna de gel dependen principalmente del volumen de la muestra y de los requisitos de resolución. La longitud de la columna de gel tiene una gran influencia en la resolución. La resolución de la columna larga es mayor que la de la columna corta, pero demasiado larga provocará irregularidades en la columna y el caudal será demasiado lento. La longitud de la columna generalmente no supera los 100 cm. Al mismo tiempo, es necesario tener un diámetro interior apropiado de la columna. Si el diámetro interior es demasiado grueso, se producirá una importante difusión lateral de las muestras de proteínas. Si el diámetro interno es demasiado delgado, la velocidad del flujo cerca de la pared interna de la columna será mayor que la velocidad del flujo en el centro, lo que dará como resultado un "efecto de pared", que afecta la velocidad y el efecto de separación. . La longitud de la columna de gel que se suele utilizar es de 25 a 70 cm, el diámetro interior es de 4 a 16 mm y la relación H/D (relación altura/diámetro) suele oscilar entre (25:1) y (100:1). La H/D de la columna de gel utilizada para la separación de grupos puede ser relativamente baja. El H/D puede estar entre (30:1)-(100:1) durante el fraccionamiento. La columna de desalinización tiene una resolución más alta debido a los requisitos más altos. Bajo, generalmente usa columnas cortas, H/D está mayormente entre (5:1)-(25:1). Si los pesos moleculares de las proteínas que se van a separar son bastante diferentes, se puede usar una columna con H/D=(15:1)-(50:1), y el volumen de la columna debe ser mayor que 4-15 veces el de la muestra. volumen. Si los pesos moleculares de las proteínas que se van a separar son diferentes. Si es más pequeño, use una columna delgada con H/D=(20:1)-(100:1), y el volumen de la columna debe ser mayor de 25 a 100 veces. el volumen de la muestra. Al purificar proteínas, la H/D de la columna debe ser (20:1)-(40:1) para una buena resolución.

Además, el tamaño de las partículas de gel también debe tenerse en cuenta al elegir una columna. Para empaquetar geles de partículas pequeñas, use una columna de mayor diámetro. Al empacar con partículas gruesas, use una columna de menor diámetro.

Pretratamiento de Geles

Los geles disponibles comercialmente generalmente están disponibles como gránulos de polvo seco (p. ej., Tandex) o suspensiones de agua (p. ej., Tanrose CL). Algunos geles que no deben almacenarse deshidratados y secos (como los geles de agarosa) deben almacenarse en una solución acuosa que contenga conservantes. No es necesario hinchar estos geles antes de usarlos. Además, el gel de sílice poroso y el vidrio poroso no requieren tratamiento de hinchamiento. Para minimizar la influencia de diferentes solventes en el volumen del lecho de la columna y obtener el efecto de separación ideal, el gel seco debe verterse lentamente en el eluyente con un volumen de 5 a 10 veces el volumen del gel seco para que se hinche por completo. Si el hinchamiento es insuficiente, no se logrará una separación efectiva y la columna de gel se romperá durante el uso.

Después de seleccionar el tipo de gel utilizado de acuerdo con el peso molecular y los requisitos de resolución de la muestra de proteína, la cantidad de gel seco utilizado se estima en función del volumen de la columna y las propiedades de absorción de agua del gel. Debido a que el gel tiene una cierta cantidad de pérdida durante el pretratamiento y la operación experimental, debe ser entre un 10 % y un 20 % más alto que el valor de cálculo teórico cuando se pesa realmente.

Diferentes tipos de geles requieren diferentes tiempos de hinchamiento. Generalmente, un gel con un tamaño más pequeño y un límite de exclusión más bajo tiene una absorción de agua más baja y un tiempo de hinchamiento más corto. Se tarda 3-4 horas a 20 °C. Un gel con un tamaño más grande y un límite de exclusión más alto El pegamento tiene una gran cantidad de absorción de agua, por lo que el tiempo de hinchamiento requerido también es más largo, y lleva más de diez horas a decenas de horas a unos 20 °C.

El hinchamiento por calentamiento es un método de pretratamiento de gel comúnmente utilizado, es decir, el polvo de gel seco pesado se disuelve en el eluyente y se calienta gradualmente hasta casi hervir. Este método puede acortar en gran medida el tiempo de hinchamiento, que generalmente puede completarse en 1 a 2 horas, y puede tener un triple efecto de hinchamiento, desgasificación y esterilización. Durante el proceso de hinchamiento del gel, la agitación debe continuarse lentamente, pero no enérgicamente, porque es fácil causar la rotura de las partículas de gel y, eventualmente, las partículas finas bloquearán la columna de gel y afectarán la velocidad de flujo y el efecto de separación. Además, debe evitarse en la medida de lo posible el calentamiento y la hinchazón en ácido o álcali para evitar daños en la estructura de malla del gel.

Después de hincharse por completo, el homogeneizado de gel debe suspenderse para ver si hay impurezas o partículas finas irregulares en el sobrenadante. Es muy importante eliminar las burbujas de aire del gel hinchado, de lo contrario afectará el efecto de separación. En general, las burbujas de aire se pueden eliminar bombeando al vacío o calentando y hirviendo. Debido al alto precio de los geles, se deben minimizar las pérdidas y desperdicios durante el uso, y los geles restantes se deben almacenar para su uso posterior.