La cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) se puede considerar como una cromatografía de fase normal que utiliza una fase móvil orgánica acuosa, por lo que a veces se denomina "cromatografía de fase normal acuosa". La columna de interacción hidrofílica es más polar que la columna de fase reversa, y el agua altamente polar se usa como solvente B. El aumento de la proporción de agua reduce la retención de la muestra (a diferencia de la cromatografía de fase inversa). Los solutos más polares e ionizados se retienen más en HIC. En la mayoría de las separaciones HILIC, la proporción de agua en la fase móvil está entre el 3% y el 40%. Cuando la proporción de agua es superior al 40%, la retención es generalmente débil.

Fase estacionaria

Las fases estacionarias que se utilizan habitualmente en la cromatografía HILIC incluyen: columna de sílice pura, columna de amino, columna de amida, columna de zwitterion, etc. Las columnas de sílice pura tienen la ventaja de una menor pérdida de fase estacionaria y son más populares cuando se utilizan detectores CAD, ELSD y LC-MS. . Las columnas de amino, utilizadas en la cromatografía HILIC, son particularmente adecuadas para la separación de carbohidratos (sacáridos). La columna zwitteriónica ya no necesita usar reactivos de emparejamiento de iones, tiene una fuerte hidrofilicidad y puede retener de manera efectiva compuestos iónicos polares fuertes débiles o no retenidos y moléculas de fármacos básicos en RP-LC.

Lo mismo es Sílice, NH2, a diferencia de la columna utilizada en la cromatografía de fase normal, la columna diseñada para la cromatografía HILIC, se puede utilizar en fase móvil agua-orgánica, es decir, la resistencia del agua de la cromatografía HILIC a la fase estacionaria Los requisitos son mayores, de lo contrario habrá problemas como un alto ruido de línea de base y una corta vida útil de la columna debido a la hidrólisis de la fase estacionaria. Por lo tanto, es posible que las columnas utilizadas en la cromatografía de fase normal no se utilicen necesariamente en la cromatografía HILIC. Las columnas adecuadas para la cromatografía HILIC se pueden utilizar en la cromatografía de fase normal.

Ventajas de HILIC

Los solutos polares se retienen preferentemente en HIC, lo que significa que muchas sustancias que no se retienen bien en la cromatografía de fase reversa se pueden separar fácilmente usando HIC.

La cromatografía de interacción hidrofílica tiene varias ventajas potenciales:

● Buena forma de pico para solutos básicos

● Ayuda a mejorar la sensibilidad de la espectrometría de masas

● Inyección directa de muestras disueltas en disolventes orgánicos

● Puede soportar caudales más altos debido a la menor viscosidad de la fase móvil

Preguntas frecuentes sobre HILIC

En comparación con la cromatografía de fase inversa, el problema más común en la cromatografía de interacción hidrófila es probablemente una forma de pico subóptima (delantera o de cola). Esto refleja el hecho de que HIC como nuevo método de separación no ha sido ampliamente utilizado como RPC. HIC aún puede utilizar sílice tipo A como material de embalaje. También debemos continuar mejorando las columnas HILIC y encontrar formas de mejorar la forma de los picos.

Cuando encuentre problemas de forma de pico, lo primero que debe intentar es aumentar la concentración de tampón en la fase móvil. Algunas muestras requieren concentraciones de tampón de hasta 100 mmol/L para obtener una buena forma de pico. En general, la muestra debe disolverse en la fase móvil, pero a veces, para mejorar la forma del pico, se puede aumentar la proporción del disolvente orgánico utilizado para disolver la muestra. Si la forma del pico aún no mejora, considere reemplazar la columna o ajustar el pH de la fase móvil. La fase móvil siempre debe contener una cierta cantidad de agua, y la proporción de agua debe ser de al menos 3%-5%.

Algunas columnas de fase ligada experimentan sangrado de columna cuando se ejecuta la detección de masas. La solución habitual es utilizar una columna de sílice u otra columna de fase ligada. Se ha señalado en la literatura que cuando se utiliza la cromatografía de interacción hidrófila, algunos componentes de la muestra se unirán irreversiblemente a la columna de sílice. En este caso, se puede considerar una columna HILIC de fase ligada.