La cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) se puede considerar como cromatografía en fase normal utilizando una fase móvil orgánica acuosa, por lo que a veces se la denomina “cromatografía en fase normal acuosa”. La columna de interacción hidrófila es más polar que la columna de fase inversa y el agua altamente polar se utiliza como disolvente B. Aumentar la proporción de agua reduce la retención de la muestra (a diferencia de la cromatografía de fase reversa). Los solutos más polares e ionizados se retienen más en HIC. En la mayoría de separaciones HILIC, la proporción de agua en la fase móvil está entre el 3% y el 40%. Cuando la proporción de agua es superior al 40%, la retención es generalmente débil.

Fase estacionaria

Las fases estacionarias que se utilizan habitualmente en la cromatografía HILIC incluyen: columna de sílice pura, columna amino, columna de amida, columna zwitterion, etc. Las columnas de sílice pura tienen la ventaja de una menor pérdida de fase estacionaria y son más populares cuando se utilizan detectores CAD, ELSD y LC-MS. . Las columnas amino, utilizadas en la cromatografía HILIC, son particularmente adecuadas para la separación de carbohidratos (sacáridos). La columna zwitteriónica ya no necesita utilizar reactivos de apareamiento iónico, tiene una fuerte hidrofilicidad y puede retener eficazmente compuestos iónicos polares fuertes débilmente o no retenidos y moléculas de fármacos básicos en RP-LC.

Lo mismo es Sílice, NH2, a diferencia de la columna que se usa en cromatografía de fase normal, la columna diseñada para cromatografía HILIC, se puede usar en fase móvil acuosa-orgánica, en otras palabras, la resistencia al agua de la cromatografía HILIC a la fase estacionaria Los requisitos son más altos, de lo contrario habrá problemas como un alto ruido de referencia y una corta vida útil de la columna debido a la hidrólisis de la fase estacionaria. Por lo tanto, es posible que las columnas utilizadas en la cromatografía de fase normal no necesariamente se utilicen en la cromatografía HILIC. En la cromatografía de fase normal se pueden utilizar columnas adecuadas para cromatografía HILIC.

Ventajas de HILIC

Los solutos polares se retienen preferentemente en HIC, lo que significa que muchas sustancias que se retienen mal en la cromatografía de fase reversa se pueden separar fácilmente usando HIC.

La cromatografía de interacción hidrofílica tiene varias ventajas potenciales:

● Buena forma de pico para solutos básicos

● Ayuda a mejorar la sensibilidad de la espectrometría de masas.

● Inyección directa de muestras disueltas en disolventes orgánicos.

● Puede soportar caudales más altos debido a la menor viscosidad de la fase móvil.

Preguntas frecuentes sobre HILIC

En comparación con la cromatografía de fase inversa, el problema más común en la cromatografía de interacción hidrófila es probablemente la forma subóptima del pico (inicial o final). Esto refleja el hecho de que el HIC como nuevo método de separación no se ha utilizado ampliamente como RPC. HIC aún puede utilizar sílice tipo A como material de embalaje. También debemos seguir mejorando las columnas HILIC y encontrar formas de mejorar la forma de los picos.

Cuando se encuentran problemas con la forma de los picos, lo primero que se debe intentar es aumentar la concentración del tampón en la fase móvil. Algunas muestras requieren concentraciones de tampón de hasta 100 mmol/L para obtener una buena forma de pico. En general, la muestra debe disolverse en la fase móvil, pero a veces, para mejorar la forma del pico, se puede aumentar la proporción del disolvente orgánico utilizado para disolver la muestra. Si la forma del pico aún no mejora, considere reemplazar la columna o ajustar el pH de la fase móvil. La fase móvil siempre debe contener una cierta cantidad de agua y la proporción de agua debe ser al menos del 3% al 5%.

Algunas columnas de fase unida experimentan sangrado de columna cuando se ejecuta la detección de masa. La solución habitual es utilizar una columna de sílice u otra columna de fase unida. Se ha señalado en la literatura que cuando se utiliza cromatografía de interacción hidrófila, algunos componentes de la muestra se unirán irreversiblemente a la columna de sílice. En este caso, se puede considerar una columna HILIC de fase enlazada.