Los reactivos de emparejamiento de iones son una clase común de reactivos de laboratorio que se pueden agregar a una fase móvil de cromatografía de fase inversa para mejorar la retención de muestras iónicas. El uso de reactivos de apareamiento de iones puede mejorar la capacidad de intercambio de iones de la superficie de la fase ligada hidrofóbica, lo que permite un mejor control de la retención de muestras ácidas o básicas en condiciones suaves de pH de la fase móvil.

El reactivo de apareamiento de iones se adsorbe en el lecho de la columna a través de la interacción de la parte hidrófoba (comúnmente heptilo y dodecilo) del reactivo con la fase estacionaria de la columna cromatográfica, de modo que la fase estacionaria tiene una cierta capacidad de intercambio iónico, mejorando así la capacidad de emparejamiento de iones. Retención de analitos de carga opuesta.

Por ejemplo, el sulfonato de octano de sodio común

El reactivo de apareamiento iónico se añade a la fase móvil, pero es en la fase estacionaria de la columna donde entra en juego. Aquí hay un ejemplo de sulfonato de octano de sodio. El reactivo de emparejamiento de iones agregado a la fase móvil ingresa a la columna con la fase móvil y el reactivo de emparejamiento de iones luego se equilibra entre la fase estacionaria y la fase móvil de la columna.

De acuerdo con el principio de atracción entre personas del mismo sexo, la cadena de carbono de 8 átomos de carbono en el octanosulfonato de sodio será adsorbida por la fase estacionaria de la columna cromatográfica débilmente polar, mientras que los iones de ácido sulfónico de mayor polaridad quedan expuestos en la fase estacionaria de la columna cromatográfica. la columna cromatográfica. en la fase móvil exterior. La fase estacionaria de la columna que adsorbe el ion sulfonato de octano está cargada negativamente, lo que le permite adsorber y retener compuestos cargados positivamente.

Además de mejorar la retención de los compuestos objetivo, los reactivos de emparejamiento de iones también mejoran la forma de los picos.

La matriz de la fase estacionaria de la columna de fase inversa es principalmente gel de sílice y hay muchos grupos hidroxilo en la superficie del gel de sílice. Durante la preparación de la columna, la fase estacionaria injertada y el proceso de protección final consumirán algunos grupos hidroxilo, pero aún queda una gran cantidad de grupos hidroxilo en la superficie de la matriz de sílice. La interacción de los grupos silanol en la superficie de la matriz de sílice con el compuesto puede causar picos de colas.

Como se mencionó anteriormente, el par de reactivos de emparejamiento de iones llenará el espacio de la fase estacionaria, y esta parte del reactivo de emparejamiento de iones puede proteger bien los grupos hidroxilo residuales en la superficie del gel de sílice. Por lo tanto, se evita la interacción entre el compuesto objetivo y el grupo hidroxilo en la superficie de sílice y se mejora el pico de cola.

Reactivos de par de iones de uso común

Acción sobre compuestos ácidos:

Hidróxido de tetrabutilamonio, cloruro de tetrabutilamonio (bromuro de tetrabutilamonio), cloruro de dodeciltrimetilamonio.

Acción sobre compuestos básicos:

Varios sulfonatos de alquilo como el sulfonato de octano de sodio

Ácido trifluoroacético, ácido pentafluoropropiónico, ácido heptafluorobutírico y otros ácidos orgánicos lineales sustituidos con perfluoro. (Los ácidos orgánicos lineales sustituidos con perfluoro son especiales, tanto los reactivos de apareamiento de iones como los ácidos fuertes que ajustan el pH).

Sin embargo, el uso de reactivos de apareamiento de iones inevitablemente causará algunos problemas. Aquí hay una introducción.

Posibles problemas y soluciones

El tiempo de equilibrio de la columna es largo.

En comparación con el método de cromatografía de fase inversa que no agrega reactivos de emparejamiento de iones, la cromatografía de emparejamiento de iones implica una variedad de procesos complejos de equilibrio, por lo que, en general, el tiempo de equilibrio de las columnas cromatográficas que utilizan reactivos de emparejamiento de iones es relativamente largo. Dado que la concentración de los reactivos de par iónico es de 2-5 mmol/L o incluso menor, deben adsorberse en la superficie de los materiales de relleno de la columna cromatográfica de fase reversa, y la concentración superficial es de 0,5-2 μmol/m2. Una columna cromatográfica de 4,6 × 250 mm tiene alrededor de 3 g de materiales de relleno, se requieren 2 mmol de reactivo de par de iones para el equilibrio completo de la columna. A una concentración de fase móvil de 2 mmol, se requiere un litro de fase móvil para el equilibrio. Estas son, por supuesto, condiciones extremas, pero es normal equilibrar una columna con unos pocos cientos de mililitros de fase móvil.

Debido al largo tiempo de equilibrio, la elección de un método de elución en gradiente cuando se utilizan reactivos de emparejamiento de iones puede generar una serie de problemas, como mala reproducibilidad de retención, líneas de base inestables y otros problemas de separación, por lo que generalmente no se recomienda para el emparejamiento de iones. métodos. Usa el método del gradiente. Sin embargo, cuando se utilizan reactivos de apareamiento de iones de molécula pequeña, como el ácido trifluoroacético (TFA) y la trietilamina (TEA), el equilibrio de la columna es más rápido y la elución del gradiente generalmente no es un problema.

Si es necesario limpiar la columna, se recomienda utilizar una solución de agua y metanol al 50 % para el mantenimiento.

Problema de forma de pico

La adición de reactivos de apareamiento de iones suele mejorar los problemas de forma de los picos causados ​​por los grupos silanol residuales en las columnas basadas en sílice. Si se producen problemas de forma de pico en los métodos de emparejamiento de iones, como la extensión del frente de pico, etc., se pueden resolver cambiando la temperatura. Por lo tanto, cuando la forma del pico no es buena o el número de platos teóricos disminuye, se puede estudiar el efecto del cambio de temperatura en la forma del pico.

Pico de disolvente en blanco

En el método de emparejamiento de iones, cuando se realiza un experimento en blanco (es decir, se inyecta el solvente de muestra), a veces aparecen picos tanto positivos como invertidos, y estos picos anormales también se denominan picos de solvente en blanco. Estos picos de disolvente en blanco interfieren con el establecimiento o el uso rutinario de métodos en fase líquida, por lo que los experimentos en blanco deben realizarse antes de establecer un método de par de iones y después de obtener una separación prometedora.

Los problemas con los picos del solvente en blanco generalmente son causados ​​por diferencias entre la fase móvil y el solvente de la muestra, que pueden magnificarse por una pureza insuficiente de la sal del tampón, la adición de reactivos de par iónico u otros aditivos de la fase móvil.

Efectos de los iones sobre las variables en el desarrollo de métodos

En comparación con el método ordinario de fase inversa, el método de par de iones puede cumplir con los requisitos del grado de separación y otros requisitos ajustando los parámetros (incluidos el pH, el tipo y la concentración del reactivo de par de iones y la temperatura).

El pH de la fase móvil: En el método de emparejamiento de iones, el pH no solo afecta el grado de ionización del analito, sino que también afecta el progreso de ionización del reactivo de emparejamiento de iones agregado y afecta el efecto de emparejamiento de iones con el analito. Por lo tanto, el cambio de pH afecta al analito. Los efectos de la retención son más complejos.
Temperatura: Los cambios de temperatura en un método de par de iones pueden causar cambios significativos en la retención relativa. La temperatura cambia la cantidad de reactivo de par iónico adsorbido en la columna, por lo que controlar la temperatura es especialmente importante para las separaciones.
Tipo y concentración de reactivos de apareamiento de iones: en la mayoría de los casos, la concentración de reactivos de apareamiento de iones en la fase estacionaria afectará el comportamiento de retención del intercambio iónico de solutos, mientras que el tipo y la concentración de reactivos de apareamiento de iones afectarán directamente su retención en la fase estacionaria. concentración.

Cuando se desea una cierta retención, se puede usar una concentración más baja de un reactivo de apareamiento de iones más hidrofóbico o una concentración más alta de un reactivo de apareamiento de iones menos hidrofóbico.

Cuando el reactivo de apareamiento de iones en la fase estacionaria está saturado, continuar aumentando la concentración del reactivo de apareamiento de iones en realidad reducirá la retención del analito, porque la concentración de contraión del reactivo de apareamiento de iones aumenta, aumentando el intercambio de iones. competencia con el analito.

Al cambiar simultáneamente el pH de la fase móvil y la concentración del reactivo de apareamiento de iones, el rango de retención y la retención relativa de las muestras iónicas se pueden controlar en gran medida.