Los reactivos de emparejamiento iónico son una clase común de reactivos de laboratorio que se pueden agregar a una fase móvil de cromatografía de fase reversa para mejorar la retención de muestras iónicas. El uso de reactivos de apareamiento iónico puede mejorar la capacidad de intercambio iónico de la superficie de la fase con enlace hidrófobo, lo que permite un mejor control de la retención de muestras ácidas o básicas en condiciones suaves de pH de la fase móvil.

El reactivo de apareamiento iónico se adsorbe en el lecho de la columna mediante la interacción de la parte hidrófoba (comúnmente heptilo y dodecilo) del reactivo con la fase estacionaria de la columna cromatográfica, de modo que la fase estacionaria tiene una cierta capacidad de intercambio iónico, mejorando así la capacidad de apareamiento iónico. Retención de analitos con cargas opuestas.

Por ejemplo, el octansulfonato de sodio común

El reactivo de emparejamiento iónico se añade a la fase móvil, pero es en la fase estacionaria de la columna donde entra en juego. A continuación se muestra un ejemplo de octanosulfonato de sodio. El reactivo de emparejamiento iónico agregado a la fase móvil ingresa a la columna con la fase móvil y luego el reactivo de emparejamiento iónico se equilibra entre la fase estacionaria y la fase móvil de la columna.

Según el principio de atracción entre personas del mismo sexo, la cadena de carbono de 8 átomos de carbono en el octanosulfonato de sodio será absorbida por la fase estacionaria de la columna cromatográfica débilmente polar, mientras que los iones de ácido sulfónico de mayor polaridad quedan expuestos en la fase estacionaria de la columna cromatográfica. en la fase móvil exterior. La fase estacionaria de la columna que adsorbe el ion octano sulfonato está cargada negativamente, lo que le permite adsorber y retener compuestos cargados positivamente.

Además de mejorar la retención de los compuestos objetivo, los reactivos de apareamiento iónico también mejoran la forma de los picos.

La matriz de la fase estacionaria de la columna de fase inversa es principalmente gel de sílice y hay muchos grupos hidroxilo en la superficie del gel de sílice. Durante la preparación de la columna, la fase estacionaria injertada y el proceso de protección terminal consumirán algunos grupos hidroxilo, pero todavía quedan una gran cantidad de grupos hidroxilo en la superficie de la matriz de sílice. La interacción de los grupos silanol en la superficie de la matriz de sílice con el compuesto puede provocar picos de cola.

Como se mencionó anteriormente, el par de reactivos de apareamiento iónico llenará el espacio de la fase estacionaria, y esta parte del reactivo de apareamiento iónico puede proteger bien los grupos hidroxilo residuales en la superficie del gel de sílice. De este modo, se evita la interacción entre el compuesto objetivo y el grupo hidroxilo en la superficie de sílice y se mejora el pico de cola.

Reactivos de pares iónicos de uso común

Acción sobre compuestos ácidos:

Hidróxido de tetrabutilamonio, cloruro de tetrabutilamonio (bromuro de tetrabutilamonio), cloruro de dodeciltrimetilamonio.

Acción sobre compuestos básicos:

Varios alquilsulfonatos, como el octanosulfonato de sodio.

Ácido trifluoroacético, ácido pentafluoropropiónico, ácido heptafluorobutírico y otros ácidos orgánicos lineales perfluorosustituidos. (Los ácidos orgánicos lineales sustituidos con perfluoro son especiales, tanto reactivos de apareamiento iónico como ácidos fuertes que ajustan el pH).

Sin embargo, el uso de reactivos de emparejamiento iónico inevitablemente causará algunos problemas. Aquí hay una introducción.

Posibles problemas y soluciones.

El tiempo de equilibrio de la columna es largo.

En comparación con el método de cromatografía de fase inversa que no agrega reactivos de apareamiento iónico, la cromatografía de apareamiento iónico implica una variedad de procesos de equilibrio complejos, por lo que, en general, el tiempo de equilibrio de las columnas cromatográficas que utilizan reactivos de apareamiento iónico es relativamente largo. Dado que la concentración de reactivos de pares iónicos es de 2 a 5 mmol/l o incluso inferior, deben adsorberse en la superficie de los materiales de relleno de la columna cromatográfica de fase inversa, y la concentración superficial es de 0,5 a 2 μmol/m2. Una columna cromatográfica de 4,6 x 250 mm tiene aproximadamente 3 g de materiales de relleno; se requieren 2 mmol de reactivo de apareamiento iónico para completar el equilibrio de la columna. Con una concentración de fase móvil de 2 mmol, se requiere un litro de fase móvil para el equilibrio. Por supuesto, estas son condiciones extremas, pero es normal equilibrar una columna con unos pocos cientos de mililitros de fase móvil.

Debido al largo tiempo de equilibrio, elegir un método de elución en gradiente cuando se utilizan reactivos de emparejamiento iónico puede generar una serie de problemas, como una reproducibilidad de retención deficiente, líneas base inestables y otros problemas de separación, por lo que generalmente no se recomienda para el emparejamiento iónico. métodos. Utilice el método del gradiente. Sin embargo, cuando se utilizan reactivos de apareamiento iónico de moléculas pequeñas, como el ácido trifluoroacético (TFA) y la trietilamina (TEA), el equilibrio de la columna es más rápido y la elución en gradiente generalmente no es un problema.

Si es necesario limpiar la columna, se recomienda utilizar una solución de metanol-agua al 50% para el mantenimiento.

Problema de forma de pico

La adición de reactivos de apareamiento iónico generalmente mejora los problemas de forma de pico causados ​​por grupos silanol residuales en columnas a base de sílice. Si se producen problemas con la forma del pico en los métodos de emparejamiento iónico, como la extensión del frente del pico, etc., se pueden resolver cambiando la temperatura. Por lo tanto, cuando la forma del pico no es buena o el número de placas teóricas disminuye, se puede estudiar el efecto del cambio de temperatura en la forma del pico.

Pico de disolvente en blanco

En el método de emparejamiento iónico, cuando se realiza un experimento en blanco (es decir, se inyecta el disolvente de la muestra), a veces aparecen picos tanto positivos como invertidos, y estos picos anormales también se denominan picos de disolvente en blanco. Estos picos de disolvente en blanco interfieren con el establecimiento o el uso rutinario de métodos en fase líquida, por lo que los experimentos en blanco deben realizarse tanto antes del establecimiento de un método de par iónico como después de que se haya obtenido una separación prometedora.

Los problemas con los picos de disolvente en blanco generalmente se deben a diferencias entre la fase móvil y el disolvente de la muestra, que pueden magnificarse por una pureza insuficiente de la sal tampón, la adición de reactivos de pares iónicos u otros aditivos de la fase móvil.

Efectos de los iones sobre las variables en el desarrollo de métodos.

En comparación con el método ordinario de fase inversa, el método de par iónico puede cumplir los requisitos de grado de separación y otros requisitos ajustando los parámetros (incluido el pH, el tipo y la concentración del reactivo de par iónico y la temperatura).

El pH de la fase móvil: En el método de emparejamiento iónico, el pH no solo afecta el grado de ionización del analito, sino que también afecta el progreso de ionización del reactivo de emparejamiento iónico agregado y afecta el efecto de emparejamiento iónico con el analito. Por tanto, el cambio de pH afecta al analito. Los efectos de la retención son más complejos.
Temperatura: Los cambios de temperatura en un método de pares iónicos pueden provocar cambios significativos en la retención relativa. La temperatura cambia la cantidad de reactivo de par iónico adsorbido en la columna, por lo que controlar la temperatura es especialmente importante para las separaciones.
Tipo y concentración de reactivos de emparejamiento iónico: en la mayoría de los casos, la concentración de reactivos de emparejamiento iónico en la fase estacionaria afectará el comportamiento de retención del intercambio iónico de solutos, mientras que el tipo y la concentración de los reactivos de emparejamiento iónico afectarán directamente su retención en la fase estacionaria. concentración.

Cuando se desea una cierta retención, se puede usar una concentración más baja de un reactivo de apareamiento iónico más hidrófobo o una concentración más alta de un reactivo de apareamiento iónico menos hidrófobo.

Cuando el reactivo de apareamiento iónico en la fase estacionaria está saturado, continuar aumentando la concentración del reactivo de apareamiento iónico en realidad reducirá la retención del analito, porque la concentración de contraión del reactivo de apareamiento iónico aumenta, aumentando el intercambio iónico. competencia con el analito.

Al cambiar simultáneamente el pH de la fase móvil y la concentración del reactivo de apareamiento iónico, se puede controlar en gran medida el rango de retención y la retención relativa de muestras iónicas.