La aplicación más importante de IMAC es la purificación de proteínas recombinantes etiquetadas con His, y la etiqueta His expresada por fusión es un fragmento que contiene 6 o más residuos de histidina. Su etiqueta tiene una alta afinidad y especificidad, por lo que en la mayoría de los casos, la purificación IMAC de un solo paso es suficiente para preparar la proteína objetivo con un cierto grado de pureza y puede cumplir con los requisitos de muchas aplicaciones. La estructura (es decir, posición, orden y longitud) de las etiquetas puede afectar la producción de proteínas de varias maneras: tasa de expresión, capacidad de unión a ligandos IMAC, estructura tridimensional de proteínas, formación de cristales de proteínas, etc.
La forma más común de His-tag se compone de 6 residuos de histidina consecutivos, que pueden proporcionar 6 sitios de unión a metales. En la mayoría de los casos, cuanto mayor sea la capacidad de cambio del equilibrio de unión/disociación, más estable será la capacidad de unión y más se inclinará el equilibrio en la dirección de la unión. Los resultados del ensayo Biacore mostraron que a pH 7,0-7,4, la tasa de disociación de la proteína marcada con hexahistidina de Ni-NTA fue 1x10⁶-1,4x10⁸. Sin embargo, la fluidez, la densidad de ligandos y la concentración de proteínas de las superficies planas de los chips son muy diferentes de las partículas porosas de agarosa. Además, la estabilidad de la interacción de las proteínas etiquetadas con His con los ligandos de IMAC se ve afectada por la accesibilidad de la etiqueta y el número total de residuos quelantes (histidina, cisteína, aspartato y glutamato) en la superficie de la proteína. Es decir, por lo general, incluso en condiciones adversas, si se puede acceder a la etiqueta His (que es el caso en la mayoría de los casos), la afinidad de la proteína por Ni-NTA es lo suficientemente alta para la cromatografía en columna.
Los ligandos más utilizados para IMAC son el ácido iminodiacético (IDA) y el ácido nitrilotriacético (NTA). grupo coordinador. Cu2, Ni2, Zn2 estos iones existen en forma de compuestos de seis coordenadas en solución acuosa. Los ligandos quelantes tienen muchos grupos de coordinación, que pueden quelar el metal con firmeza, pero el metal tiene pocos sitios para la coordinación de proteínas y la fuerza de unión a la proteína se debilita. Por lo tanto, la unión de IDA a la proteína es generalmente más fuerte que la de NTA; sin embargo, NTA y metal quelan firmemente, y el ion metálico no es fácil de caer.

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