La aplicación más importante de IMAC es la purificación de proteínas recombinantes marcadas con His, y la etiqueta His expresada por fusión es un fragmento que contiene 6 o más residuos de histidina. Su etiqueta tiene alta afinidad y especificidad, por lo que en la mayoría de los casos, la purificación IMAC en un solo paso es suficiente para preparar la proteína objetivo con un cierto grado de pureza y puede cumplir con los requisitos de muchas aplicaciones. La estructura (es decir, posición, orden y longitud) de las etiquetas puede afectar la producción de proteínas de varias maneras: tasa de expresión, capacidad de unión a ligandos IMAC, estructura tridimensional de las proteínas, formación de cristales de proteínas, etc.
La forma más común de etiqueta His se compone de 6 residuos de histidina consecutivos, que pueden proporcionar 6 sitios de unión a metales. En la mayoría de los casos, cuanto mayor es la capacidad de cambio del equilibrio de unión/disociación, más estable es la capacidad de unión y más se inclina el equilibrio en la dirección de la unión. Los resultados del ensayo Biacore mostraron que a pH 7,0-7,4, la tasa de disociación de la proteína marcada con hexahistidina de Ni-NTA fue de 1 x 10⁶-1,4 x 10⁸. Sin embargo, la fluidez, la densidad del ligando y la concentración de proteínas de las superficies de los chips planos son muy diferentes de las de las partículas de agarosa porosas. Además, la estabilidad de la interacción de las proteínas marcadas con His con ligandos IMAC se ve afectada por la accesibilidad de la etiqueta y el número de residuos quelantes totales (histidina, cisteína, aspartato y glutamato) en la superficie de la proteína. Es decir, generalmente incluso en condiciones difíciles, si la etiqueta His es accesible (que es el caso en la mayoría de los casos), la afinidad de la proteína por Ni-NTA es lo suficientemente alta para la cromatografía en columna.
Los ligandos más utilizados para IMAC son el ácido iminodiacético (IDA) y el ácido nitrilotriacético (NTA). grupo coordinador. Cu2, Ni2, Zn2, estos iones existen en forma de compuestos de seis coordenadas en solución acuosa. Los ligandos quelantes tienen muchos grupos de coordinación, que pueden quelar el metal firmemente, pero el metal tiene pocos sitios para la coordinación de proteínas y la fuerza de unión a la proteína se debilita. Por tanto, la unión de IDA a las proteínas es generalmente más fuerte que la de NTA; sin embargo, el NTA y el metal se quelan firmemente y el ion metálico no se desprende fácilmente.

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