En los intercambiadores de aniones, el orden de fuerza vinculante es:

F– ＜ Cl– ＜Br– ＜I–

Para las macromoléculas biológicas cargadas, como las proteínas, la capacidad de unión a los intercambiadores de iones depende primero del pH de la solución, que determina el estado de carga de la proteína, y luego de la región cromatográficamente relevante de la proteína, es decir, la distribución de cargas en la superficie de la proteína. han sido mencionados antes. Además, también depende de la especie y la fuerza iónica de los iones en la solución. Los iones inorgánicos y las proteínas en la solución se unen competitivamente al intercambiador. Bajo las condiciones iniciales, la fuerza iónica en la solución es baja. Después de la carga, debido a la gran cantidad de cargas en la proteína, la capacidad de unión con el intercambiador es más fuerte. Puede reemplazar iones y adsorberse en el intercambiador. Durante la elución, la fuerza iónica de la solución a menudo aumenta, la capacidad de unión competitiva de los iones aumenta y la muestra de proteína se desorbe del intercambiador, que es la esencia de la cromatografía de intercambio iónico.

Efectos del pH y la fuerza iónica I

El pH y la fuerza iónica son factores importantes que controlan el comportamiento de intercambio iónico de proteínas, resolución, recuperación, etc.

El pH determina la carga de las proteínas y los intercambiadores de iones y, por lo tanto, es el parámetro más importante para determinar si las proteínas se adsorben. Al realizar la separación, el pH debe controlarse para que la proteína y el intercambiador de iones estén cargados de manera opuesta, y aquí hay dos aspectos involucrados. Por un lado, el intercambiador de iones tiene un rango de pH de trabajo dentro del cual se puede garantizar que el intercambiador de iones esté suficientemente cargado. Generalmente, los intercambiadores de cationes se aplican con un límite de pH más bajo, por debajo del cual una gran parte de los grupos de intercambio iónico pierden su carga negativa y ya no pueden unirse a los cationes. Los intercambiadores de aniones se aplican con un límite de pH superior, por encima del cual pH Habrá una gran fracción de los grupos de intercambio de iones que pierden su carga positiva y ya no pueden unir aniones. Por otro lado, el pH de la solución determina directamente el tipo y la cantidad de proteína cargada. La elección de un pH adecuado puede garantizar que la molécula de proteína objetivo y el intercambiador de iones se adsorban con cargas opuestas. Al mismo tiempo, si el pH está demasiado lejos del punto isoeléctrico de la proteína, la proteína y el intercambiador de iones se unen con demasiada fuerza y ​​no se eluyen fácilmente.

Al elegir el pH operativo, se debe prestar especial atención al rango de estabilidad del pH de la proteína objetivo. Si el pH excede este rango, la actividad de la proteína se perderá y la tasa de recuperación disminuirá. Especialmente debido al efecto Daunan, el pH de la superficie del intercambiador de iones no es consistente con el pH de la solución. En el microambiente en la superficie del intercambiador de cationes, los grupos de intercambio de cationes atraen H y los iones OH₋ son repelidos, lo que da como resultado que el pH de la superficie del intercambiador sea 1 unidad de pH más bajo que el del tampón circundante. En el microambiente en la superficie del intercambiador de aniones, el OH₋ es atraído por los grupos de intercambio de aniones y los iones de H son repelidos, lo que hace que el pH de la superficie del intercambiador sea 1 unidad de pH más alto que el del tampón circundante. Por ejemplo, una determinada proteína es adsorbida por un intercambiador de cationes a pH=5. De hecho, la proteína se encuentra en un ambiente de pH=4 en la superficie del intercambiador. Si la proteína es inestable a este pH, se inactivará. La mayoría de las proteínas son menos estables y menos recuperables por debajo de pH=4.

Dado que otros iones en solución compiten con las proteínas para unirse al intercambiador de iones, las especies iónicas y la fuerza iónica I son otro factor importante que afecta la unión y elución de proteínas. Bajo la condición de baja fuerza iónica I, la proteína se une al grupo funcional con carga opuesta en el intercambiador de iones a través del grupo cargado. Cuando la concentración de iones competidores, es decir, la fuerza iónica I, aumenta gradualmente, la proteína se reemplaza gradualmente. Para una proteína con un número de carga específico, qué tan alta es la concentración de sal requerida para eluirla del intercambiador de iones, no hay una regla fija y debe explorarse a partir del experimento. La mayoría de las proteínas se pueden eluir a una concentración de sal de 1 mol/L, por lo que en la etapa de exploración de condiciones, las personas suelen establecer la concentración final de sal eluida en 1 mol/L. De hecho, las sales a menudo desempeñan un papel en la estabilización de la estructura de la proteína en solución. Para evitar la desnaturalización o precipitación de proteínas, la fuerza iónica no debe ser demasiado baja. Además, el tipo de ion también es un factor importante, la capacidad de los diferentes iones para desplazar las proteínas del intercambiador es diferente y el tipo de ion también tendrá un impacto en la resolución y el orden de elución de las diferentes proteínas.

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