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2025-02-21El intercambiador de iones está compuesto por una matriz polimérica insoluble, grupos funcionales cargados y contraiones con cargas opuestas a los grupos funcionales. iones) pueden ser adsorbidos en su superficie por atracción electrostática. De esta manera, existe una relación competitiva entre varios iones e intercambiadores de iones cuando se combinan.
La capacidad de unión de los iones inorgánicos y de los intercambiadores es proporcional a la carga de los iones e inversamente proporcional al radio de los iones hidratados formados por los iones. Es decir, cuanto mayor sea el estado de valencia del ion, más fuerte será la fuerza de unión, y cuando el estado de valencia es el mismo, cuanto mayor sea el número atómico, más fuerte será la fuerza de unión. En los intercambiadores de cationes, el orden de intensidad de la fuerza de unión de iones comunes es:
En los intercambiadores aniónicos, el orden de fuerza vinculante es:
F– < Cl–
Para macromoléculas biológicas cargadas, como las proteínas, la capacidad de unión a los intercambiadores de iones depende primero del pH de la solución, que determina el estado de carga de la proteína, y luego de la región cromatográficamente relevante de la proteína, es decir, de la distribución de cargas en la superficie de la proteína. han sido mencionados antes. Además, también depende de las especies y la fuerza iónica de los iones en la solución. Los iones inorgánicos y las proteínas de la solución se unen competitivamente al intercambiador. En las condiciones iniciales, la fuerza iónica de la solución es baja. Después de la carga, debido a la gran cantidad de cargas en la proteína, la capacidad de unión con el intercambiador es más fuerte. Puede reemplazar iones y adsorberse en el intercambiador. Durante la elución, la fuerza iónica de la solución a menudo aumenta, la capacidad de unión competitiva de los iones aumenta y la muestra de proteína se desorbe del intercambiador, que es la esencia de la cromatografía de intercambio iónico.
El pH y la fuerza iónica I son factores importantes que controlan el comportamiento, la resolución, la recuperación, etc. del intercambio iónico de proteínas.
El pH determina la carga de las proteínas y de los intercambiadores de iones y, por tanto, es el parámetro más importante para determinar si las proteínas se adsorben. Al realizar la separación se debe controlar el pH para que la proteína y el intercambiador de iones tengan cargas opuestas, y aquí intervienen dos aspectos. Por un lado, el intercambiador de iones tiene un rango de pH de trabajo, dentro del cual se puede garantizar que el intercambiador de iones esté suficientemente cargado. Generalmente, los intercambiadores de cationes se utilizan con un límite de pH inferior, por debajo del cual una gran parte de los grupos de intercambio iónico pierden su carga negativa y ya no pueden unirse a cationes. Los intercambiadores aniónicos se aplican con un límite superior de pH, por encima del cual habrá una gran fracción de grupos de intercambio iónico que perderán su carga positiva y ya no podrán unirse a aniones. Por otro lado, el pH de la solución determina directamente el tipo y cantidad de proteína cargada. La elección de un pH adecuado puede garantizar que la molécula de proteína objetivo y el intercambiador de iones se absorban con cargas opuestas. Al mismo tiempo, si el pH está demasiado alejado del punto isoeléctrico de la proteína, la proteína y el intercambiador de iones se unen demasiado fuertemente y no se eluyen fácilmente.
Al elegir el pH operativo, se debe prestar especial atención al rango de estabilidad del pH de la proteína objetivo. Si el pH excede este rango, la actividad proteica se perderá y la tasa de recuperación disminuirá. Especialmente debido al efecto Daunan, el pH de la superficie del intercambiador de iones no coincide con el pH de la solución. En el microambiente de la superficie del intercambiador de cationes, los grupos de intercambio catiónico atraen el H y los iones OH₋ son repelidos, lo que hace que el pH de la superficie del intercambiador sea 1 unidad de pH inferior al del tampón circundante. En el microambiente de la superficie del intercambiador aniónico, el OH₋ es atraído por los grupos de intercambio aniónico y los iones H son repelidos, lo que hace que el pH de la superficie del intercambiador sea 1 unidad de pH más alto que el del tampón circundante. Por ejemplo, una determinada proteína es absorbida por un intercambiador de cationes a pH = 5. De hecho, la proteína se encuentra en un ambiente de pH=4 en la superficie del intercambiador. Si la proteína es inestable a este pH, se inactivará. La mayoría de las proteínas son menos estables y menos recuperables por debajo de un pH = 4.
Dado que otros iones en solución compiten con las proteínas por la unión al intercambiador de iones, las especies iónicas y la fuerza iónica I son otro factor importante que afecta la unión y elución de las proteínas. En condiciones de baja fuerza iónica I, la proteína se une al grupo funcional con carga opuesta en el intercambiador de iones a través del grupo cargado. Cuando la concentración de iones competidores, es decir, la fuerza iónica I, aumenta gradualmente, la proteína se reemplaza gradualmente. Para una proteína con un número de carga específico, no existe una regla fija sobre qué tan alta es la concentración de sal necesaria para eluirla del intercambiador de iones y debe explorarse a partir del experimento. La mayoría de las proteínas se pueden eluir a una concentración de sal de 1 mol/L, por lo que en la etapa de exploración de las condiciones, la gente suele establecer la concentración final de sal eluida en 1 mol/L. De hecho, las sales suelen desempeñar un papel en la estabilización de la estructura de las proteínas en solución. Para evitar la desnaturalización o precipitación de proteínas, la fuerza iónica no debe ser demasiado baja. Además, el tipo de ion también es un factor importante, la capacidad de diferentes iones para desplazar proteínas del intercambiador es diferente y el tipo de ion también tendrá un impacto en la resolución y el orden de elución de diferentes proteínas.
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